METODE PENENTUAN NILAI PARAMETER SIFAT LIPOFILIK SENYAWA OBAT

Pengetahuan tentang partisi penting untuk ahli farmasi karena prinsip ini melibatkan beberapa bidang ilmu farmasetik. Termasuk di sini pengawetan system minyak-air, kerja obat pada yang tidak spesifik, absorbsi dan distribusi obat ke seluruh tubuh.Teori-teori tentang absorpsi, ekstraksi dan kromatografi banyak terkait dengan teori koefisien partikel (Martin,Alfred. 1990). Kecepatan absorpsi obat sangat dipengaruhi oleh koefisien partisinya. Hal ini disebabkan oleh komponen dinding usus yang sebagian besar terdiri dari lipida. Dengan demikian obat-obat yang mudah larut dalam lipida akan dengan melaluinya. Sebaliknya obat-obat sukar larut dalam lipida akan sukar diabsorpsi. Obat-obat yang mudah larut dalam lipida tersebut dengan sendirinya memiliki koefisien partisi yang besar, sebaliknya obat-obat yang sukar larut dalam lipida akan memiliki koefisien partisi lipida air kecil. Lipofilisitas bisa dilihat dari koefisien partisi dan ikatan hidrogen. Koefisien partisi merupakan perbandingan kelarutan di dalam lemak dibanding air (Sri,et al. 2011).

Pada umumnya obat-obat bersifat asam lemah atau basa lemah. Jika obat tersebut dilarutkan dalam air sebagian akan terionisasi. Besarnya fraksi obat yang terionkan tergantung pada pH larutannya. Obat-obat yang tidak terionkan lebih mudah larut dalam lipida, sebaliknya yang dalam bentuk ion kelarutannya kecil atau bahkan praktis tidak larut. Dengan demikian pengaruh pH sangat besar terhadap kecepatan absorpsi obat yang bersifat asam lemah atau basa lemah (Sardjoko, 1987).

Koefisien partisi tiap zat adalah tetap sesuai dengan sifat alamiah zat itu sendiri. (Sarwoko, et al. 2005). Lipofilisitas bisa dilihat dari koefisien partisi dan ikatan hidrogen. Koefisien partisi merupakan perbandingan kelarutan di dalam lemak dibanding air. Cl bersifat lipofil (+), sedangkan OH hidrofil ( -). Proses awal penentu obat dalam mencapai target adalah penetrasi atau absorpsi. Penetrasi obat dalam membran biologi tergantung pada kelarutan obat dalam lipid. Makin mudah larut dalam lipid, obat tersebut makin mudah menembus membran dan makin banyak yang diabsorp-si. Hal ini disebabkan sebagian besar membran biologi tersusun oleh lipid, seperti membran sel pembungkus lambung, mukosa usus halus dan membran jaringan sya-raf 5,6 Obat supaya mudah larut dalam lipid harus bersifat non polar atau lipofilik. Lipofilisitas obat dapat didefinisikan sebagai kadar keseimbangan numerik kadar obat dalam fase polar dibagi kadar obat dalam fase non polar.5,7 Adapun parameter lipofilisitas yang sering digunakan dalam hubungan kuantitatif struktur dan aktivitas bio-logi antara lain adalah logaritma koefisien partisi, tetap-an pi (π) Hansch, tetapan fragmentasi F Nys Rekker dan harga Rm.7 Ada beberapa metode analisis untuk menentukan lipo-filisitas obat, yaitu secara spektrofotometri, kromato-grafi cair kinerja tinggi (KCKT/HPLC), kromatografi gas dan kromatografi lapis tipis fase terbalik (RPTLC= reversed phase thin layer chromatography). (Ratna,et al. 2009)

           

A.    Metode Penentuan Nilai Logaritma Koefisien Partisi

Nilai logarita koefisien partisi (log P) suatu senyawa dapat ditentukan secara percobaan, dengan perhitungan teoritis cara Hansch, cara Rekker, dan cara Hansch-Leo.

Ø  Penentuan Nilai Logaritma Koefisien Partisi Secara Percobaan

Suatu senyawa yang dapat larut dalam dua pelarut yang tidak saling campur maka senyawa akan terdistribusi kedalam fasa polar (misal : air) dan fasa non polar (misal : oktanol, kloroform, karbontetraklorida). Setelah tercapai kesetimbangan ternyata kadar senyawa dalam kedua pelarut tersebut selalu tetap (pada suhu yang tetap) sehingga dapat ditentukan nilai koefisien partisi adalah tetapan kesetimbangan suatu senyawa dalam system pelarut non polar dan polar, yang secara logaritma  berhubungan dengan energy bebas.

Berikut adalah parameter-parameter yang termasuk ke dalam parameter lipofilisitas :

                        koefisien partisi (log P) merupakan salah satu sifat fisika kimia yang penting dalam menggambarkan aktivitas biologis suatu senyawa. Koefisien partisi dapat digunakan untuk menunjukkan kemampuan suatu molekul dalam menembus membran biologis yang bersifat seperti halnya lapisan lemak (Hansch, et al, 1972). Koefisien partisi digunakan dalam persamaan matematika yang mencoba menghubungkan aktivitas biologis suatu obat dengan karakteristik fisika dan kimianya (Cairns, 2004). Koefisien partisi dihitung melalui persamaan sbb:

P = C_o/C_w

C_o                 : Kadar bentuk molekul obat dalam minyak (pelarut non polar )

C_w            : kadar bentuk molekul obat dalam air (pelarut polar)

Bila tidak ada interaksi antara zat dan pelarut, maka :

C_o = C_m – C_w                                                       C_m  : kadar zat mula-mula

Untuk senyawa yang terionisasi, pengaruh derajat ionisasi (α) tidak boleh di abaikan.

P =  C_o/C_w (1-α)

Nilai P senyawa sangat bervariasi dengan jarak yang sangat besar, untuk memudahkan perhitungan biasanya digunakan dalam bentuk logaritmanya (log P), sehingga :

Log P = log C_o – log C_w

Untuk senyawa yang terionisasi,

Log P = log C_o – log C_w (1-α)

Untuk mengitung nilai α dapat di cari melalui persamaan Henderson-hesselbach sebagai berikut

pH = pKa + log C_j/C_u                              Cu = (1- α) dan Cj = α

pKa          : tetapan ionisasi

C_u                : kadar bentuk molekul senyawa/bentuk yang tidak terionisasi

C_j             : kadar senyawa yang terionisasi

Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam metode ini, antara lain:

·         Untuk senyawa yang bersifat asam atau basa, di dalam air, perlu untuk didapar hingga diperoleh 99,9% senyawa dalam bentuk molekul tak terion. Oleh karena itu, penting untuk mengetahui pKa-nya.

·         Senyawa harus stabil dalam kondisi yang dipilih, dan tidak terjadi reaksi serta tidak mempengaruhi analisis.

               Pelarut yang bisa digunakan sebagai fase lipid atau fase pelarut nonpolar ada berbagai macam yang bisa digunakan. telah dijelaskan pelarut Oktanol lebih biasa digunakan. Alasannya adalah karena Oktanol memiliki sifat yang mendekati sifat atau karakter dari biomembran yaitu sukar larut dalam air, mempunyai gugus donor dan akseptor ikatan hidrogen, tidak akan terjadi desolvatasi, tekanan uapnya sangat rendah, dan toksisitasnya yang rendah. Selain itu, Oktanol juga bersifat transparan serta cut off UV-nya rendah.

Ø  Penentuan Nilai Logaritma koefisien partisi Teoritis Cara Hansch-Fujita

Bagaimana jika ingin mengetahui parameter lipofilik untuk senyawa yang masih dalam rancangan dan belum disintesis? 

Hansch dan Fujita memiliki suatu sistem untuk menjawab persoalan tersebut. Keduanya mengembangkan suatu metode untuk perhitungan sifat lipofilik senyawa dengan menyesuaikan persamaan Hammet untuk lipofilisitas. Berikut adalah rumus perhitungannya:

Sistem Hansch dan Fujita ternyata kurang memuaskan karena adanya beberapa alasan antara lain:

·         Tidak dapat digunakan untuk menghitung log P senyawa yang memiliki bobot molekul rendah.

·         Nilai pi (H) yang dikatakan = 0,00 diragukan.

·   Faktor melipat (folding) karena adanya dipol hanya berlaku pada momen dipol adanya elektronegativitas X.

·    Ada bukti bahwa interaksi difenhidramin dengan model reseptor terikat dalam bentuk tidak  melipat sehingga perhitungan log P difenhidramin dainggap kurang mantap.

Ø  Penentuan Nilai Logaritma Koefisien Partisi Teoritis Cara Rekker

Kemudian Nys dan Rekker (1973) menyelidiki sejumlah senyawa dan melakukan analisis regresi, dan menemukan bahwa nilai lipofilisitas H pada CH, CH₂, CH₃ serta substituen atom C jenuh tidak sama dengan 0,00 pada atom H-nya, jadi atom H memiliki nilai juga. Dalam hal ini, mereka mengusulkan parameter pengganti pi yaitu f sebagai bagian dari penusun struktur dari seluruh fragmen. Dengan demikian perhitungannya untuk senyawa tertentu akan menjadi seperti di bawah ini:

Penelitian untuk mendapatkan nilai lipofilisitas fragmen dilakukan secara bertahap dan berkelanjutan, dengan menyelidiki ribuan senyawa yang mewakili berbagai jenis struktur. Jadi penelitiannya terus berkembang dan diperbaiki. Pada tahun 1979, Rekker mempublikasikan tabel tetapan fragmen dan dipublikasikan kembali oleh Rekker dan manhold (1992) setelah dilakukan penyempurnaan.

Terdapat suatu paramater dalam perhitungannya yaitu Magic Constant (Cm) suatu tetapan aneh yang digunakan untuk memperbaiki ketidaksesuaian antara log P pengamatan dengan log P hitungan berdasarkan penjumlahan fragmen yang mana bernilai 0,289. Dengan ini, persamaan penentuan Log P menjadi:

           

Berikut adalah ringkasan dari faktor Cm untuk beberapa macam senyawa.

Ø  Penentuan Nilai Logaritma Koefisien Partisi Teoritis Cara Hansch-Leo

Selain system hidrofobik fragmental dari Nys-Rekker, yang kemudian di sempurnakan oleh Rekker-Mannhold, Hansh-Leo (1979)juga mempublikasikan cara menghitung koefisien partisi dengan metode fragmen menggunakan tetapan fragentasi  f  melalui persamaan berikut :

Dari berbagai metode penentuan log P di atas,tetapan hidrofobik π Hansch-Fujita, tetapan F Rekker–Mannhold, dan tetapan f  Hansch-Leo, pada umumnya di gunakan untuk mencari hubungan kualitatif struktur dan aktifitas dari suatu turunan obat.

Tetapan π Hansch-Fujita lebih baik di gunakan bila perubahan struktur senyawa induk hanya terjadi pada satu gugus, sedang untuk perubahan struktur lebih kompleks lebih baik di gunakan perhitungan dengan tetapan f Rekker-Mannhold atau tetapan f Hansch-Leo.

Karena banyaknya factor-faktor koreksi pada penentuan nilai log P secara perhitungan, maka yang paling ideal adalah langsung menentukkan log P secara percobaan. Nilai log P secara perhitungan pada umumnya digunakan untuk studi hubungan kuantitatif struktur-aktivitas dari suatu turunan senyawa.

B.     Penentuan Lipofilitas Dengan Metode Kromatografi

Ada beberapa metode analisis untuk menentukan lipofilisitas obat, yaitu secara spektrofotometri, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT/HPLC), kromatografi gas dan kromatografi lapis tipis fase terbalik (RPTLC= reversed phase thin layer chromatography). Metode RPTLC merupakan metode yang mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya sederhana, cepat, sampel yang digunakan sedikit dan yang penting lagi adalah untuk senyawa-senyawa yang tidak mempunyai gugus kromofor dapat dikerjakan. Adapun yang menjadi kendala faktor keberhasilan dengan metoda RPTLC adalah pemilihan fase gerak atau eluen, campuran atau kombinasi serta perbandingan jumlah campuran eluen yang digunakan dalam proses elusinya.

Metode konvensional dikenal juga sebagai metode penggojogan, merupakan metode yang membosankan dan cukup sulit terutama jika senyawa mempunyai kelarutan yang sangat kecil (Boyce dan Milborrow, 1965). Boyce dan Milborrow (1965) mengemukakan suatu metode sederhana, cepat dan banyak digunakan dewasa ini, yaitu metode kromatografi lapis tipis sistem reverse phase (RPTLC), dengan memanfaatkan hubungan antara koefisien partisi (π) dan harga Rf yang diperoleh dari kromatografi partisi cair-cair. Silika gel yang dilapisi parafin cair digunakan sebagai fase diam. Fase diam lain yang dapat digunakan adalah poliamida, dalam hal ini parafin diganti dengan minyak silikon (Rekker, 1986) 

Fase gerak yang digunakan adalah campuran aseton-air atau pelarut organik lainnya yang dapat campur dengan air seperti metanol dan etanol, kadang-kadang agar lebih baik ditambahkan etilasetat. Fase gerak dijenuhi dulu dengan fase diamnya yaitu parafin cair atau minyak silikon. Perbandingan antara pelarut organik dan airnya tergantung lipofilisitas senyawa yang diselidiki, senyawa yang memiliki lipofilisitas tinggi tidak dapat bergerak jika dielusi dengan fase gerak yang mengandung konsentrasi air yang tinggi. Lempeng dikembangkan setelah sampel ditotolkan, pengembangan dilakukan dengan teknik menaik sampai fase geraknya mencapai jarak 15 cm dari tempat penotolan, setelah kering kemudian dideteksi dan dihitung harga Rf-nya (Rekker, 1986).

Deteksi dapat dilakukan mengunakan metode pembentukan senyawa yang memberikan reaksi warna dengan gugus fungsional dari senyawa yang diselidiki, selain itu dapat juga digunakan lampu ultraviolet untuk mendeteksi senyawa yang mempunyai inti aromatis. Selanjutnya log P dihitung dengan rumus :

log P = log K + RM

Dimana, K = tetapan yang harganya tergantung sistem kromatografi yang digunakan, RM=retention modified

Rm = log {(1/Rf)-1)}

Metode ini biasanya digunakan jika hanya tersedia sejumlah bahan yang diselidiki dan apabila senyawa yang diselidiki diduga mengandung bahan pengotor. Bahan pengotor dapat terlihat pada lempeng namun dapat dibedakan dari bercak utama (Rekker, 1986).